Role of RHBDD2 in membrane trafficking regulation

Tese de mestrado, Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015RHBDD2 é parcialmente relacionada com romboides, protéases intra-membranares que degradam substratos na via secretora. Curiosamente, um subgrupo da família romboide, incluindo a RHBDD2, não tem resíduos catalíticos essenciais. Estas “pseudo-proteases” são conservadas, o que implica uma pressão seletiva para manter a sua função durante a evolução. Recentemente, uma mutação pontual (R85H) foi identificada no gene humano que codifica para a proteína RHBDD2, e está associada a uma doença neuro-degenerativa chamada Retinitis Pigmentosa (RP). Esta mutação pontual de G para A, alterou o aminoácido codificado de arginina para histidina no códão 85 do Segundo exão. No entanto a relevância fisiológica da RHBDD2 e a sua contribuição para a doença acima referida não é clara. Os dois maiores focos deste estudo foram (1) a investigação de como a mutação R85H na RHBDD2 contribui para a doença a nível celular; (2) investigar a função da RHBDD2 nativa a nível da célula e do organismo. Vários programas de alinhamento (ClustalO, muscle, tcoffee ferramentas de alinhamento) foram usados para prever a topologia da RHBDD2. Com base na comparação com outros membros da superfamília romboide, os domínios transmembranares (TMD) da RHBDD2 foram previstos. Após identificar cuidadosamente todos os aminoácidos chave nos alinhamentos, eu previ que a RHBDD2 é uma proteína transmembranar com 6 TMD, com ambas as terminações N- e C- presentes na face citoplasmática. Devido ao conhecimento prévio de que a RHBDD2 é expressa em níveis elevados na retina, consistente com a expressão a nível do mRNA na base de dados bioGPS, células de ratinho RPE foram selecionadas como materiais essenciais para as seguintes experiências. Plasmídeos para a sobre-expressão da RHBDD2 WT e da mutação R85H com uma tag de HA no C-terminal foram gerados no vector pLEX MCS, e usados para gerar células estáveis por transdução lentiviral. Estas linhas celulares juntamente com a linha celular com o vector vazio (EV) foram usadas para investigar a função da RHBDD2 a nível bioquímico e da biologia celular. Surpreendentemente, a expressão da forma mutante da RHBDD2 em células RPE, não induziu um stress constitutivo do retículo endoplasmático (RE). Não houce degradação da proteína mutante na linha celular R85H. Isto permitiu-me propor de forma preliminar, que o fenótipo da mutação R85H não é causado por stress do (RE). Por forma a analisar a localização do Et e mutante R85H, células RPE foram marcadas com um anticorpo anti-HA (para detectar RHBDD2 WT e mutante R85H) e com o marcador de stress do RE Calreticulin ou o marcador do cis-Golgi GM130. Imagens de imuno-fluorescência e co-localização mostraram que tanto a WT como a mutante RHBDD2 localizam predominantemente no aparelho de Golgi. Indicando que a mutante R85H localiza-se no mesmo compartimento celular que a proteína nativa, sugerindo que o fenótipo da doença não é causado por stress do RE ou por falta de folding da proteína. Ratinhos com deleção genética (KO) na RHBDD2 foram gerados pelo sistema CRISPR/Cas9 para definir a função da RHBDD2 e o fenótipo dos animais mutantes. Infelizmente, 5 animais fundadores morreram no primeiro dia de vida. Analise do tecido revelou que dois deles tinham INDELs e três deles eram nativos. Logo, a morte dos animais é pouco provável estar relacionada com o genótipo RHBDD2. A experiência foi repetida e 17 potencias fundadores foram obtidos. Resultados de sequênciaçao indicaram que dois animais fundadores tinham a mutação desejada, provavelmente como quimeras. Identificamos também animais fundadores com INDELs de 6 e 9 pares de bases. Experiências de imuno-precepitação acopladas a espectrometria de massa foram realizadas para identificar novos interactores da RHBDD2. Três IPs foram efetuados em diferentes condições (com ou sem crosslinker, acoplado com diferentes tampões de lavagem). Golgins (GM160, Golgin-84, Golgin-45), que atuam como plataformas de acoplamento membranar, foram co-immuno-precepitadas coma RHBDD2 em ambas as experiências com cross-linker, indicando que a RHBDD2 pode ter um papel na manutenção da estrutura do aparelho de Golgi. Componentes chaves das vesículas COPII foram também capturados nos IPs crosslinked e não crosslinked, indicando que a RHBDD2 pode contribuir para o transporte ER para Golgi dependente de COPII. Estes dois grupos apareceram tanto nos IPs da proteína RHBDD2 nativa como mutante R85H. De notar, o número total de identificações de peptídeos está diminuído em IPs de R85H em condições de crosslinking ou na sua ausência, indicando talvez que o mutante R85H, exibe uma alteração conformacional que resulta numa mudança de repertório de interactores. De acordo com as IPs, experiências de fragmentação do Golgi e da sua reorganização, foram efectuadas com RNA de interferência curto (siRNA) para fazer a atenuação da expressão (KD) de RHBDD2 em células HeLa. /2 horas após a transfecçao, as células foram tratadas com BFA, e depois a droga foi removida do meio. De seguida, as células foram fixadas a diferentes pontos de incubação. Esta experiência não resultou em nenhuma diferença óbvia, na cinética de da morfologia do aparelho de Golgi entre as células tratadas control ou com o KD, mas é importante notar que o siRNA não promove a atenuçao complete da expressão da RHBDD2, logo a presença de alguma RHBDD2 residual pode ter prevenido a observação de um fenótipo mais marcado. O papel fisiológico da RHBDD2 permanece desconhecido. Considerando os possíveis parceiros de ligação da RHBDD2 e a localização da RHBDD2, eu proponho que trabalho future se deva focar no teste do tráfego celular e da glicosilação em células sem expressão de RHBDD2 (KO). Também seria útil gerar um mutante R85H endógeno nas células RPE para avaliar a patologia da mutação, e claro, para avaliar o fenótipo dos ratinhos mutantes

A case study of the robustness and the usability of CAPTCHA

The websites and network application experienced explosive growth in the past two decades. As the evolution of smartphones and mobile communication network have evolved, smart phone s user experience has been improved to a high level, and more and more people prefer to use smartphones. However, the development of techniques will not only increase the users experience but also bring threats of cracking. The development of techniques brought the potential threats to websites security. As a result, CAPTCHA, Completely Automated Public Turing test to tell Computers and Humans Apart, forms one of the methods to impede spamming attacks. As CAPTCHA s definition indicates, CAPTCHA should be recognized by humans easily while shouldn t be recognized computers. These two attributes of CAPTCHA can be considered as usability and robustness. Some CAPTCHA is difficult to be recognized by computers, but humans may also find difficult to recognize it. Therefore, the purpose of the thesis is to find out the balance between usability and robustness of CAPTCHA. Therefore, the related researches about the usability and the robustness of CAPTCHA will be reviewed, and the process of automatic CAPTCHA recognition will be Figured out and implemented by the author. The implementation will be based on the existed algorithms and a case study. The findings are the factors for improving CAPTCHA s robustness. They are from the each step of a specific process of automatic CAPTCHA recognition. Then the factors will be compared with the issues which are from the related usability research. The discussion will derive some possible ways, such as adding confusing characters and increasing data s diversity to improve robustness while keeping the usability according to the derived factors

SiTAR: Situated Trajectory Analysis for In-the-Wild Pose Error Estimation

Virtual content instability caused by device pose tracking error remains a prevalent issue in markerless augmented reality (AR), especially on smartphones and tablets. However, when examining environments which will host AR experiences, it is challenging to determine where those instability artifacts will occur; we rarely have access to ground truth pose to measure pose error, and even if pose error is available, traditional visualizations do not connect that data with the real environment, limiting their usefulness. To address these issues we present SiTAR (Situated Trajectory Analysis for Augmented Reality), the first situated trajectory analysis system for AR that incorporates estimates of pose tracking error. We start by developing the first uncertainty-based pose error estimation method for visual-inertial simultaneous localization and mapping (VI-SLAM), which allows us to obtain pose error estimates without ground truth; we achieve an average accuracy of up to 96.1% and an average F1 score of up to 0.77 in our evaluations on four VI-SLAM datasets. Next we present our SiTAR system, implemented for ARCore devices, combining a backend that supplies uncertainty-based pose error estimates with a frontend that generates situated trajectory visualizations. Finally, we evaluate the efficacy of SiTAR in realistic conditions by testing three visualization techniques in an in-the-wild study with 15 users and 13 diverse environments; this study reveals the impact both environment scale and the properties of surfaces present can have on user experience and task performance.Comment: To appear in Proceedings of IEEE ISMAR 202

Numerical Solutions of a Gradient-Elastic Kirchhoff Plate Model on Convex and Concave Geometries Using Isogeometric Analysis

In this work, we study numerical solutions of a gradient-elastic Kirchhoff plate model on convex and concave geometries. For a convex plate, we first show the well-posedness of the model. Then, we split the sixth-order partial differential equation (PDE) into a system of three second-order PDEs. The solution of the resulting system coincides with that of the original PDE. This is verified with convergence studies performed by solving the sixth-order PDE directly (direct method) using isogeometric analysis (IGA) and the system of second-order PDEs (split method) using both IGA and C0 finite elements. Next, we study a concave pie-shaped plate, which has one re-entrant point. The well-posedness of the model on the concave domain is proved. Numerical solutions obtained using the split method differ significantly from that of the direct method. The split method may even lead to nonphysical solutions. We conclude that for gradient-elastic Kirchhoff plates with concave corners, it is necessary to use the direct method with IGA